Aids Research and Therapy 2010, 7:31
Erradicación específica de VIH-1 de células cultivadas infectadas
Aviad Levin1, Zvi Hayouka2, Assaf Friedler2, Abraham Loyter1*
Correspondencia; loyter@cc.huji.ac.il 1 Departamento de Química Biológica, Instituto de Ciencias de la Vida Alexander Silberman: Universidad Hebrea de Jerusalén, Safra Campus, Givat Ram, Jerusalem 91904, Israel. Hay lista plena de información de autores disponible al fin del artículo.
Resumen
Se estableció previamente una correlación entre la integración del cDNA del Virus de la Inmunodeficiencia Humana [(HIV-1) cDNA] y la muerte celular. Aquí mostramos cómo la combinación de péptidos que estimulan la integración junto con el inhibidor de proteasa Ro 31-8959 causaron la muerte por apoptosis de las células infectadas con VIH, con total exterminio del virus. Esta combinación no tuvo ningún efecto en las células no infectadas. Por tanto parece que la muerte celular se promueve solamente en las células infectadas. Es nuestra idea que si los resultados descritos en este trabajo sugieren un nuevo abordaje a promover específicamente la muerte de las células infectadas de VIH-1 y por tanto pueden eventualmente desarrollarse en una nueva terapia antiviral general.
Resultados
No hay actualmente cura o vacuna disponibles para el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), ni tampoco para el resultante Síndroma de Inmuno Deficiencia Adquirida (SIDA) [1]. Sin embargo, se usa en la actualidad una terapia antirretroviral altamente activa (TARVAA = HAART), que bloquea las actividades de la trascriptasa reversa y la proteasa virales e inhibe el proceso de fusión virus-huésped [2,3]. La TARVAA transforma el proceso de infección en una enfermedad crónica [4-6]. Además, el riesgo de infección puede ser reducido significativamente si el tratamiento TARVAA se da inmediatamente después de la exposición al virus [7].
Se están desarrollando constantemente nuevos abordajes terapéuticos y nuevos inhibidores antivirales para obtener una major restricción del proceso de infección del HIV-1 [8-19]. Sin embargo, una vez que el cDNA viral se integra en el cromosoma del huésped es casi imposible liquidar el proceso de infección y curar el SIDA. Hace poco se sugirió un modo de erradicar el cDNA viral integrado en el cromosoma huésped estimulando el proceso de desintegración mediado por la Integrasa (IN) viral [20,21]. Sin embargo, este abordaje solamente está en sus pasos iniciales. [20].
La células infectadas de HIV-1, a diferencia de las células infectadas por otros retrovirus, llevan solamente 1-2 copias del cDNA/celular viral integrado [22,23]. Esto a pesar de la presencia de numerosas copias de cDNA viral no integrado [22,24]. Recientemente hemos mostrado que esta restricción se debe a la inhicición de la actividad IN viral asín como de su importanción nuclear por una protein Rev tempranamente expresada que sigue a la interacción Rev-IN [25-30]. La disrupción del complejo Rev-IN complex por peptides celulares permeables derivados de IN, tales como las INS [31] e INrs [28], da como resultado la muliintegración del cDNA viral [26,28,31]. Resultados previos han mostrado que la multiintegración del DNA viral en pacientes de SIDA puede conducer a instabilidad genómica del huésped [32]. A decir verdad, nosotros demostramos recientemente una correlación entre la promoción de multiintegración y el al aumento de muerte celular [25].
Basándonos en estas observaciones hemos desarrollado un Nuevo abordaje para erradicar específica y significativamente células infectadas de HIV-1 así como los viriones infecciosos de células cultivadas. Como puede verse en la Fig. 1a, la adición de peptides estimuladores de la integración INS o INr o una combinación de ambos (150 μM de cada uno) a células infectadas por un tipo salvaje [wild type (WT)] de HIV-1 aumentó significativamente la aparición de nuevos viriones durante los primeros 6 a 8 dias después de la infección [post infection (PI)]. Sin embargo, a partir del octavo día PI se puede observer una disminución en producción de virus.. Los resultados de Fig. 1b muestran que el grado de la reducción estádirectamente correlacionado con la MDI (multiplicidad de infección) [MOI (multiplicity of infection)] del HIV-1 infectado. Se obtuvo una erradicación casi complete de viriones cuando cuando las células infectadas estaban en presencia de los péptidos INS e INr peptides, por un tenor relativamente alto del virus (Fig. 1b). Esta erradicación (Figs. 1a y 1b) probablemente se debe a la promoción de muerte celular (Fig. 1c), que a su vez es resultado de la estimulación inducida por los péptidos del proceso de integración (Fig. 1dI y véase [28]). Nuestros resultados indican que en períodos muy largos PI se obtiene una complete erradición de partículas del virus (Fig. 1).
Cuando se agregó el inhibidor de protease específico de HIV-1 (Ro 318959 [33]) a células infectadas con virus junto con o bien el INS o bien los péptidos de INRrs o con ambos (la mezcla del INS, INrs y Ro 31-8959 fue designada como Mix, véase Fig. 1) eñ aumento en producción de virus (Fig. 1a) y en integración de cDNA vrral (Fig. 1dII) se observó solamente durante los primeros 2-4 días PI. ¨Por otra parte una drastic reducción tanto en la producción de virus como en la integración de cDNA pudo ser observada desde cuarto día PI y en adelante, alcanzando puntos bajo los nivels de detección en presencia de la Mix (Fig. 1a yd 1dII). Como puede verse (Fig. 1c) alredor del 40% de las células cultivadas murieron al llegar el octavo día PI siguiendo a la adición de la Mix. Este porcentaje puede representar la cantidad relativa de células infectadas de virus, probablemente indicando la muerte total de esas células. Además, nuestros resultados (Figs. 1a and 1d II) claramente muestran que en ese tiempo (8 días PI) la gran mayoría del virus había sido barrido del cultivo. Por lo tanto es concebible que el aumento en el procentaje de células viable observado entre los días PI 8-12 (Fig. 1c) se deba a la división de células no infectadas.
Figure 1 Muerte específica de células infectadas de HIV-1. (a) H9 Las células de linfocitos T fueron infectadas por el WT HIV-1 en MOI de 0.1, exactamente como se describió [28], y después las células infectadas fueron tratadas cada dos días con las molésculas o combinaciones indicadas. Cada dos días se sacó una muestra y su tenor de virus se estimó por sistema MAGI [the MAGI assay] [37] usando células TZM-bl exactamente como se describió [28]. (b) La células linfocitos T H9 se infectaron con WT HIV-1 en los MOIs indicados y se trataron con INS or INS+INrs. Ka cantidad de producción de virus se estimó usando el dispositivo MAGI en Células TZM-bl en 48 h PI. (c) Lo mismo que (a) pero la viabilidad de las células fue estimada por el dispositivoe MTT como se describe en [28]. (dI) y (dII) Lo mismo que (a) pero la cantidad promedio de eventos/células de integración de cDNA viral fue estimada por PCR de Tiempo Real cuantitativo semianidado exactamente como se describe en [28]. Las células crecen como se describe en [28]. Se producen virus y el tenor de stock viral se estimó como se describe en [29]. Los péptidos se sintetizaron y purificaron como se describe en [28,31]. Las siguientes concentraciones se usaron: AZT 2 μM, Ro 31-8959 10 nM, INS/INrs 150 μM. Cada experimento se ejecutó al menos tres veces con un error relativo no mayor de ±10%. Las barras de error representan la desviación estandar.
Para determiner si el tratamiento detallado arriba (combinacion of INS + INrs y Ro 31-8959) en verdad da como resultado la erradicación de los viriones infectados y la aniquilación del proceso de infección, se condujo el siguiente experiment:o: las células cultivadas fueron infectadas por el WT HIV en MDI de 1 y 24 h PI células frueron tratadas, cada dos días, con Ro 31-8959, INS+Ro 31-8959, INrs+Ro 318959 o la Mix por la duración total de dos semanas. Siguiendo este período se dejó que las células tratadas crecieran sin tratamiento por dos semanas adicionales.
Al fin de cada uno de estos periodos, a saber: pretratamiento, después de dos semanas de tratamiento y dos semanas después de la finalización del tratamiento (cuatro semans PI), se estimaron las cantidades promedio de copias / por célula de RNA viral RNA (Fig. 2a), de total de copias por célula de DNA viral (Fig. 2b) y de cDNA viral integrado por célula (Fig. 2c) así como las cantidades de proteína virual viral p24 (Fig. 2d) y la aparición de nuevos viriones (Fig. 2e).
Figure 2 Erradicacion de intección de HIV-1. Las células linfocitos T H9l fueron infectadas con el WT HIV-1at MOI de 1, exacta,emte cp,p se describe en [28]. Compenzando a 24 h PI las células infectadas fueron tratadas cada dos días con las molésculas indicadas durante dos semanas. Al finalizar el tratamiento de dos semanas, se dejó que las células crecieran sin tratamiento. (a) La cantidad promedio de copias de RNA viral se estimó como se describe en [38]: antes del tratamiento, al final del tratamiento de dos semanas y dos semanas después de la finalización del tratamiento (cuatro semanas PI). (b) lo mismo que en (a) pero la cantidad promedio de copias virales de DNA por célula fueron estimadas como se describe en [29,39]. (c) Lo mismo que en (a) ´pero la cantidad promedio de eventos de integración por células se estimó como se describe en [28]. (d) Lo mismo que en (a) pero la cantidad promedio de p24 viral fue estimado como se describe ein [30](e) La cantidad de virus infeccioso producida por las células fue estima como se describe en [28]. Todas las demás condiciones como se describen en Fig. 1.
Como puede verse se observe siguiendo las primeras dos semanas de tratamiento una reducción sustancial de producción e integración de virus(Fig. 2), Sin embargo, cuando se puso fin al tratamiento con diversas combinaciones de peptides y el inhibidor de protease, la producción e integración de virus se restauró, excepto en las células tratadas con el Mix, lo que indica que un Mix induce completa erradicación de la infección (Fig. 2).
Parece que la muerte de células por INS y INrs es en su mayor parte inducida por un sendero de apoptosis 3-dependiente de caspasa. Esto puede inferirse del análisis western blot que muestra la aparición de caspasa 3e activa (marcador de apoptosis [34]) (Fig. 3). Por otra parte no se pudo observar muerte celular por autofagia o necrosis siguiendo al análoisis de western blot que usaba el anti apg16 (marcador de autofagia [35])
Sebe advertirse que la posibilidad de que un peuqeño número de DNA viral integrado siga estando presente no puede excluirse totalmente. Actualmente se están llevando a cabo en nuestros laboratorios nuevos experimentos para studios la reactivación de esos pocos provirus latentes, si es que existen.
Sacamos como conclusion que la estimulación de la integración viral por los peptides INS y INrs, combinada con la prevención de la producción de virios por el inhibidor de protease, no solamente dieron como resultado el bloqueo de la infection de HIV-1 sino también el exterminio de las células infectadas al invocar la apoptosis. Este tratamiento ha limpiado el cultivo de células de células que porten los provirus integrados..Debería sin embargo agregarse que este abordaje novedoso descrito aquí para la terapia del SIDA está solamente en sus pasos iniciales y que actualmente están siendo conducidos en nuestro laboratorio nuevos intentos de mejorar la actividad de los péptidos estimulantes.
Figure 3 Correlacion entre muerte cellular y tratamiento. Las células T linfocito H9 fueron infectadas con WT HIV-1 en MOI de 1, exactamente como se describe en [28]. Comenzando a las 24 horas PI las células infectadas fueron tratadas cada dos días con las moléculas indicadas durante dos semanas. Siguiendo las dos semanas de tratamiento las células fueron lisadas como se describe en [25,29] y los conjuntos lisados fueron sujetos a anális western blo para actina como se describe en [25,29] buscando los marcadores de muerte celular (Apg16 marcador de autofagia [35], TNF marcador de necrosis [36] y caspasa 3 activa marcadora de apoptosis [34]) como se describe en [40] y por la p24 viral como se describe en [41].
Acknowledgements
This work was supported by the Israeli Science Foundation (A. Loyter) and by a starting grant from the European Research Council (ERC) (to AF). Cells and WT HIV-1 virus were provided by the NIH Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Bethesda, MD, USA).
Author details: Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences; The Hebrew University of Jerusalem, Safra Campus, Givat Ram, Jerusalem 91904, Israel. 2Institute of Chemistry; The Hebrew University of Jerusalem, Safra Campus, Givat Ram, Jerusalem 91904, Israel.
Authors’ contributions: A. Levin designed and performed the experiments, analyzed data and contributed to writing the paper; ZH performed peptide synthesis and purification; AF designed the study, and contributed to the writing; A. Loyter designed the study, contributed to the writing of the paper and coordinated the study. All authors have read and approved the manuscript.
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.
Received: 7 May 2010 Accepted: 19 August 2010 Published: 19 August 2010
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