Bockland et al 2005 Segunda X en madres de VHOM

Publicado por docentesdiversidaden en Orientación Sexual e Identidad de Género

Hum Genet (2006) 118: 691–694

RIGINAL INVESTIGATION

Extremo apartamiento estadístico de la inactivación del cromosoma X en madres de hombres homosexuales

Sven Bocklandt Æ Steve Horvath Æ Eric VilainDean H. Hamer

Received: 6 September 2005; accepted: 1 December 2005; published online: 21 December 2005

S. Bocklandt (&) Æ S. Horvath Æ E. Vilain

Department of Human Genetics, University of California, Los Angeles, CA, USA

E-mail: sbocklandt@mednet.ucla.edu

Tel.: +1-310-2672456 Fax: +1-310-7945446

S. Horvath

Department of Biostatistics, University of California, Los Angeles, CA, USA

D. H. Hamer Æ S. Bocklandt

Laboratory of Biochemistry, National Cancer Institute, Bethesda, MD, USA

S. Bocklandt

Gonda 5524, 695 Charles Young Drive South, Los Angeles, CA 90095-7088, USA

Resumen

 

La preferencia sexual humana es un rasgo sexualmente dimórfico con un componente genético sustancial. La vinculación de la orientación sexual del varón con marcadores del cromosoma X ha sido informada en algunas familias. Aquí medimos las tasas de inactivación del cromosoma X en 97 madres de hombres homosexuales y 103 mujeres de control de edad emparejada sin hijos gays. La cantidad de mujeres con un extremo apartamiento estadístico [skewing] de inactivación de X fue significativamente más alta en las madres de los hombres gays (13/97=13%) comparadas con las controles (4/103=4%) y aumentó en las madres con dos o más hijos gays (10/44=23%). Nuestros resultados dan apoyo a la suposición de que el cromosoma X tiene un papel en la regulación de la orientación sexual en subgrupo de hombres gays.

 

 

Introducción

La variación en la preferencia sexual humana tiene un componente genético sustancial, y en algunos estudios (Green and Keverne 2000; Hamer et al. 1993; Turner 1995) pero no en todos (Bailey et al. 1999) se encontró sesgo materno en el patrón de herencia de los varones. Desde el trabajo más temprano sobre la base genética de la orientación sexual se estudió el cromosoma X, considerándolo una locación posible para genes que influyeran en ese rasgo. El cromosoma X ha acumulado genes que influyen en el sexo, la reproducción y la cognición (Graves et al. 2002). La vinculación a marcadores del cromosoma X implicó un rol para los genes del cromosoma X en la orientación sexual en algunas familias (Hamer 1999).

Como las células del varón contienen solamente un cromosoma X y las células de la mujer contienen dos, cada célula de un embrión de mujer inactiva al azar un cromosoma X bien temprano en el desarrollo, con lo que crea la compensación de dosaje. Como la elección de cuál cromosoma X es el que se va a inactivar se hace al azar en la mayoría de los tejidos, y el cromosoma inactivo sigue inactivo en todas las células hijas que resultan de las divisiones celulares, una muestra de tejido de una mujer típicamente contienen células que tienen un cromosoma X inactivado y células que tienen el otro inactivado (Brown and Robinson 2000). Un patrón no azarosa de inactivación podría ser causado o bien por una inactivación primaria no azarosa en la que uno de los dos cromosomas X fuera inactivado preferencialmente o por una inactivación al azar seguida por una selección secundaria en busca de células que inactivaran un cromosoma o el otro, o bien podría resultar por casualidad (Brown and Robinson 2000). Otra forma de selección no azarosa del cromosoma X puede ocurrir cuando una pequeña población celular precursora está presente en el momento de la inactivación de X (Sandovici et al. 2004).

Aqui mostraremos que la cantidad de mujeres con una extrema distorsión [skewing] de la inactivación cromosómica es significativamente más alta en las madres de los hombres homosexuales que en las mujeres de control emparejadas con ellas por edad que no tenían hijos gays.

Materials and methods

Sample

The sample of 200 women consisted of 40 previously reported mothers of 2 or more gay sons, of whom 4 had 3 gay sons and one had 4 gay sons (Hamer et al. 1993; Hu et al. 1995); 57 newly recruited mothers of whom 4 had 2 gay sons and 53 had 1 gay son and 103 control women who did not report having homosexual children (Sabol et al. 1999). No detailed sexual behavior or attitude data was collected on the children of control mothers. Participants signed an informed consent approved by the NCI IRB prior to donating blood for DNA extraction. Sexual orientation of the gay sons was assessed through the Kinsey scales of sexual attraction, fantasy, behavior and self-identification, which range from 0 for exclusively heterosexual to 6 for exclusively homosexual. The gay sons had an average score of 5.65±0.48 (mean±SD).

X-inactivation assay

DNA was prepared from white blood cells using the same protocol for all samples (Bioserve Biotechnologies, Laurel, MD, USA). The fraction of white blood cell DNA in which one or the other of the X chromosomes was inactivated was determined by polymerase chain reaction (PCR) amplification of a highly polymorphic CAG repeat in the androgen receptor (AR) locus. The

DNA was digested with a control enzyme that does not cut the amplified fragment (RsaI), to avoid that chromatin structures would lead to preferential amplification of the more accessible alleles. Similarly, the DNA was digested with RsaI and a methylation-sensitive restriction enzyme (HpaII) together (Allen et al. 1992), and both digests were PCR amplified. Fluorescently labeled products were quantified on an ABI 3100 automated sequencer (Applied Biosystems). The peak height was

measured using Genotyper software (Applied Biosystems). The ratio of the peak heights of the two alleles after the control RsaI digest was used as a correction factor for preferential amplification of one of the alleles. The ratio of the peak heights of the two alleles after the methylation-sensitive HpaII digest was, after this correction, converted into the percentage of cells inactivating each of the alleles. The largest of the two percentage values was used. The assay was performed twice, and the mean was used in further analysis. A similar assay was performed at the fragile X (FMR1) locus (Carrel and Willard 1996), with 84 cases informative for either of the two assays and 116 women

informative for both assays, in which case the values of the two assays were averaged. The results of the assays in women heterozygous for both loci were highly correlated (Pearson r=0.75, n=143, P<0.001), and the means were not different (AR mean=70.4, SE=0.9; FMR mean=69.9, SE=1.1).

Results

To study X-inactivation ratios in women with gay sons, we determined the fraction of white blood cells inactivating one or the other X chromosome in 97 mothers of homosexual men and 103 control women, matched for ethnicity and age because of the effect of age on Xinactivation ratios (Sandovici et al. 2004). Using a methylation assay, we measured X-inactivation ratios at the androgen receptor locus (AR) and at the Fragile X mental retardation locus (FMR1). The results of both assays were averaged for further analysis.

Fig. 1 Distribución de rezones de inactivación de X en madres de hombres homosexuales y mujeres de control. Se muestra la cantidad de mujeres por cada fracción de células sanguíneas blancas en la inactivación del mismo cromosoma X. Las barras negras representan casos de extreme apartamiento estadístico de la inactivación de X (>90% skewing): a mujeres de control (N=103), b madres de hombres gays (N=97), c madres de hijo único gay (N=53), d madres de uno o más hijos gays (N=44)

A 90% cut-off value for X-inactivation ratios is widely used (Brown and Robinson 2000; Ozbalkan et al. 2005; Pegoraro et al. 1997) to define extreme skewing of X-inactivation. By this criterion, only 4% of the controls (4/103) displayed extreme skewing, while 13% of the mothers of gay men (13/97) did (P=0.021, Fisher’s exact test) (Fig. 1a, b). Those with two or more gay sons showed even more skewing (10/44 mothers=23%), and this was significantly different when compared to mothers with no gay sons (P=0.00093) (Fig. 1c, d).

The results were still valid when the control group was limited to women who have sons. The extreme skewing found in controls with sons (1/51) was significantly different when compared to women with gay sons (13/97, P=0.035). None of the controls with two or more sons showed extreme skewing (0/21), and this was significantly different compared to women with two or more gay sons (10/44, P=0.024). Furthermore, the AR and FMR1 assays separately showed significant differences in skewing as well (P=0.017 and 0.010, respectively; Table 1). The total number of sons or the number of heterosexual sons had no effect on skewing.

There was no difference in mean skewing between controls and mothers of gay men (controls: mean 70.8; mothers of gay sons: mean 69.9), but the variance differed significantly [controls: S2=112.8 versus mothers of two or more gay sons: S2=224.7, P=0.016 (Levene’s

test for difference of variance)].

No evidence was detected for factors confounding the relationship between the X-inactivation ratio and having gay sons, including age, weight, height (Spearman’s correlation test) or ethnicity (Kruskal–Wallis multigroup comparison test). The grandparental origin of the active versus inactive X chromosome could not be determined because DNA was not available from the parents of the middle-aged mothers. There was no preferential transmission of the active or inactive alleles of the AR or FMR1 to the gay sons.

Table 1 X-inactivation data per assay
Number of gay sons AR FMR Combined
Skewing of X-inactivation % Skewing of X-inactivation % Skewing of X-inactivation %
>90% <90% <90% >90% <90% >90%
0 89 4 4 74 4 5 99 4 4
1 46 1 2 32 2 8 50 3 6
2 or more 33 7 17 18 6 25 34 10 23
P=0.017 P=0.010 P=0.00093
Se muestran la cantidad de sujetos en cada categoría que despliegan inactivación de X normal (90%) y el procentaje de mujeres que muestran extremo apartamiento estadístico for the assay on the androgen receptor locus (AR), the fragile X mental retardation locus (FMR1) and the combination of both assays. The combined data consists of the AR and FMR1 results of those women that were informative for just one of the assays and of the average results of those women for which both assays were informative. P values are Fisher’s exact test comparisons between 0 and 2 or more gay sons

An increased maternal aunt/uncle ratio was found for male-to-female transsexuals (Green and Keverne 2000) and homosexual men (Turner 1995). Since this increased ratio is hypothesized to be caused by male lethality, we analyzed the sister/brother ratio in our sample of mothers with and without extreme skewing of X-inactivation. The extremely skewed women did not show such increase (total of 13 sisters/15 brothers). Women without extreme skewing of X-inactivation showed a trend towards an increased sister/brother ratio, but this did not reach significance (89 sisters/70 brothers, one-sided P=0.077, test of proportions for binomial distributions).

Variations in size of the AR locus DNA repeats have been correlated with certain diseases (Biancalana et al. 1992). However, there was no difference in the distribution of allele sizes  between mothers of gay men and controls, and a previous analysis on a large number of our samples showed that variations in the AR gene are not a common determinant of male sexual orientation (Macke et al. 1993). There was no preferential inactivation of the smaller or larger AR alleles in the extremely skewed mothers.

Discusión

Encontramos un aumento significativo en el apartamiento estadístico [distorsión: skewing] de la inactivación del cromosoma X en madres de hijos gays en comparación con mujeres sin hijos gays, especialmente en mujeres con dos o más hijos varones homosexuales. No es claro si la desusada inactivación de X influyó directamente en la orientación sexual de los hijos a través de un mecanismo tal como el efecto de orden de nacimiento fraterno (Blanchard 2001), o si es simplemente la consecuencia de un mecanismo que influyen en la orientación sexual. La extrema distorsión [skewing] de la inactivación de X encontrada en madres con dos o más hijos gays podría ser el resultado de una inactivación primaria no azarosa, por ejemplo por diferencias de alelos en el centro de inactivación de X (Brown and Robinson 2000). Se ha sugerido también como causa potencial de la distorsión extrema a la desusada impronta de genes improntados y todavía no identificados en el cromosoma X (Bocklandt and Hamer 2003). De modo alternativo, una inactivación azarosa podría haber sido seguida por una selección en busca de células que hayan inactivado un cromosoma o el otro (Brown and Robinson 2000). Esto podría ocurrir cuando la variación de secuencia que influye en la orientación sexual de los niños y niñas aumenta o disminuye el crecimiento o supervivencia de las células sanguíneas blancas o de las células ramas [stem cells] en la madre.

Recientemente, varios loci autosómicos identificados sugirieron una regulación multigen del sendero de la orientación sexual (Mustanski et al. 2005), como era lo esperado para un rasgo comportamental complejo. Formulamos como hipótesis que un sendero neuronal central establece la atracción sexual o bien hacia mujeres o bien hacia varones, y lo hace habitualmente hacia el sexo opuesto. Sin embargo, una variedad de efectos biológicos genéticos y no genéticos pueden intersecar con este sendero. De esto se deriva que podría haber varios subgrupos de hombres y mujeres gays, cada uno con su propio origen biológico específico. Aunque estos resultados necesitan todavía ser replicados, el patron inhabitual de metilación del cromosoma X de nuestra muestra de madres de hombres homosexuals da apoyo a que el cromosoma X tenga un rol en regular la orientación sexual del varón, y ofrece una senda para la investigación futura sobre la base (epi)genética de un rasgo humano complejo y biológicamente crítico.

Acknowledgements We would like to thank all the families whose participation in this study made our work possible.

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